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华中科技大学同济医学院:《今幸胶囊对小鼠 Lewis 肺癌的免疫调

文章来源:本站原创作者:admin 发布时间:2019-11-06

  华中科技大学同济医学院实验研究《今幸胶囊免疫调控功效》部分报告:《今幸胶囊对小鼠 Lewis 肺癌的免疫调控作用》

  今幸胶囊由浙江亚克药业有限公司提供(样品批号:170601),内容物为类白色颗粒,感官检查未见异常。

  C57BL/6J 雄性小鼠,6 周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于华中科技大学同济医学院无特定病原体(SPF)级实验动物中心,适应性喂养一周后用于实验。

  超净工作台、CO2 培养箱、荧光倒置显微镜、高速冷冻离心机、超纯水机、电子天平、流式细胞仪、恒温振荡器、压力蒸汽灭菌锅、4℃、-20℃、-80℃冰箱、低速离心机、多功能酶标仪、电热鼓风干燥箱。

  Lewis 细胞,培养于含有 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基,37℃、5%CO2 培养箱中培养,每两天按 1:3 传代。

  收集对数生长期的 Lewis 小鼠肺癌细胞,调整细胞密度为 2*107 个/mL。除正常对照组注射等体积的 PBS 溶液外,将癌细胞混悬液按每只 0.2mL 注射于

  C57BL/6J 小鼠右腋皮下,建立小鼠 Lewis 肺癌皮下移植瘤模型,每天一次,观察小鼠的成瘤情况。

  1.6.3 试验分组和给药方法(空白组 10 只,其他组每组 15 只)

  环磷酰胺(CY)组:荷瘤鼠每隔两天腹腔注射 CY 50mg/kg,连续注射三周。今幸胶囊(今幸)组:荷瘤鼠每天灌胃 今幸 10mg/kg(前期预实验筛选出的最佳剂量,该剂量以人参皂苷 Rh2 计。),连续给药三周。

  CY(1w)+今幸(2w)组:荷瘤鼠每隔两天腹腔注射 CY 50 mg/kg,给药一周,之后每天灌胃 今幸 10mg/kg,连续两周。

  每天称量小鼠体重,测量瘤体积,观察小鼠活动及毛皮颜色等。末次给药后, 小鼠经眼眶取血后,颈椎脱臼处死,取胸腺、淋巴结、脾脏、肝脏、内脏脂肪称重。分离脾脏、胸腺和淋巴结淋巴细胞以及骨髓来源的 DCs 测定相关指标。

  无菌条件下迅速取出脾脏,取部分脾组织制备脾淋巴细胞。将脾脏组织放入约含 5ml 无菌 PBS 的培养皿内,清洗三次,用胶头滴管研磨脾脏,经 100 目尼龙筛网过滤,收集细胞悬液于离心管中。1200rmin-1 离心五分钟,加入红细胞裂解液 1ml,1700rmin-1 离心五分钟,再用无菌 PBS 洗涤细胞三遍,用 RPMI-1640 培养基重悬细胞。于倒置显微镜下细胞计数,细胞活力测定需>90%,并调整细

  研磨脾脏、胸腺和淋巴结,分别制成 1*107 个/ml 的细胞悬液备用,用 PBS

  取每只小鼠的胫骨和股骨,洗净并分离骨髓,100 目尼龙网过滤去除杂质, 用无菌 PBS 清洗后得到骨髓细胞悬液;加入 1ml 红细胞裂解液,避光反应 2min, 加 3ml PBS 终止,再用 3ml PBS 清洗一遍,计数板计数,用 RPMI-1640 培养基调整细胞浓度约为 2*106 个/ml。取 2ml 细胞悬液加入 6 孔培养板中,再加入rmGM-CSF(20ng/ml)和 rmIL-4(10ng/ml)细胞因子后在 37℃,5%CO2 培养箱中培养。每两天半换液,并在倒置显微镜下观察细胞形态、生长情况及集落的数量和大小。第七天收集细胞待用。

  在酶标板上分别设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中加样品稀释液 25L, 然后再加待测血清 25L,样品最终稀释度为 2.5 倍。用封板膜封板后置 37℃孵育 30min。揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒弃去, 重复5 次。每孔加酶标试剂50l,空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30min,洗板 5 次。每孔先加入显色剂 A 50L,再加入显色剂 B 50L,轻轻震荡混匀,

  模型组肿瘤体积一直处于上升状态,今幸 组和 TP-5 组肿瘤体积的减小幅度不及 CY 组,但与模型组相比,肿瘤体积减小明显。联合给药组中,CY+今幸 组肿瘤体积及减小的幅度与 CY 组相当,CY+TP-5 组肿瘤体积的减小幅度不及

  CY 组小鼠体重明显下降,且一直处于下降状态。今幸 组和 TP-5 组基本保持稳定,且缓慢上升,今幸 组上升幅度大于 TP-5 组,CY 组体重下降幅度最大。CY+今幸 组、CY(1w)+今幸(2w)组和 CY+TP-5 组小鼠体重下降,但下降幅度均小于 CY 组。CY(1w)+TP-5(2w)组小鼠的体重波动范围不大(图 2A)。

  实验中除 K 组、今幸 组和 TP-5 组,其余组小鼠均出现死亡,CY 组死亡率最高(图 2B)。

  提示 今幸 单用或与化疗药联合应用对小鼠的体重都有一定的维持作用, 且单独用药时,今幸 的效果较 TP-5 好,此外 今幸 单用或与化疗药联合应用都能降低死亡率。

  M 组血清中 TNF-的含量低于 K 组,给药后 今幸 组显著上调(图 3A),

  M 组 IL-12 含量低于 K 组,给药后都增加,除 CY 组和 CY(1w)+TP-5(2w)组都有显著性差异,提示 今幸 可促进血清中IL-12的分泌(图3E)。

  M 组与 K 组相比,脾脏中的 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例下降,胸腺中的 CD4+T 细胞的比例下降,淋巴结中的 CD8+T 细胞的比例下降:

  CD4+T 细胞(脾脏)(图 4A):M 组低于 K 组,给药后比例均轻微上调, 但 TP-5 单用或联合用药组的上调作用都强于 今幸;提示 今幸 单用或与化疗药联合用药能上调脾脏中 CD4+T 细胞的比例,但不及 TP-5;

  组比例均上调、CY(1w)+今幸(2w)组上调幅度最大,今幸 组次之,提示 今幸单用或与化疗药联合用药能上调胸腺中 CD4+T 细胞的比例;

  CD4+T 细胞(淋巴结)(图 4C):M 组高于 K 组,给药后除 CY 组、今幸 组和 TP-5 组比例均上调, CY+今幸 组上调幅度最大,CY(1w)+今幸(2w) 组次之,提示 今幸 与化疗药联合用药能上调淋巴结中 CD4+T 细胞的比例;

  CD8+T 细胞(脾脏)(图 4A):M 组低于K 组,给药后 CY+TP-5 组、CY+今幸组和 CY (1w)+今幸(2w)组比例上调,CY+TP-5 组的上调幅度略大于剩余两组, 提示 今幸 与化疗药联合用药能上调脾脏中 CD8+T 细胞的比例,但不及 TP-5;

  CD8+T 细胞(胸腺)(图 4B):M 组略高于 K 组,给药后只有 CY+今幸

  组比例上调,提示 今幸 与化疗药同时用药能上调胸腺中 CD8+T 细胞的比例;

  CD8+T 细胞(淋巴结)(图 4C):M 组低于 K 组,给药后 今幸 组、TP-5 组和 CY(1w)+TP-5(2w)组比例上调,其中 今幸 组上调幅度最大,提示 今幸 单用能上调淋巴结中 CD8+T 细胞的比例;

  结果提示单用一种药物时,今幸 对脾脏和胸腺中的 CD4+T 细胞以及淋巴结中的 CD8+T 细胞的比例有上调作用,与 CY 联合用药时,对脾脏和胸腺中的CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞、淋巴结中 CD4+T 细胞的比例有上调作用。细胞的比例。B 为胸腺中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例。C 为淋巴结中 CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的比例。

  M 组 NK 细胞比例低于 K 组,给药后除 CY 组和 CY+TP-5 组均出现不同程度地上调,CY(1w)+今幸(2w)组上调最明显,其次为 CY+今幸 组。结果提示,今幸 单用或与化疗药同时应用都能上调脾脏中 NK 细胞的比例,增强免疫。

  M 组低于 K 组,给药后除 CY 组、TP-5 组和 CY(1w)+TP-5(2w)组比例均上调,CY+今幸 组上调幅度最大,其次为 CY+TP-5 组,今幸 组,提示 今幸 单用或与化疗药联合应用都能上调脾脏中巨噬细胞的比例,增强免疫。

  调,CY+TP-5 组上调幅度最大,CY+今幸 组次之,10位95后缔造疯狂转会市场!西甲3人破亿曼联阿森纳搅翻英超提示该模型下 今幸 与化疗药同时用药能上调脾脏中 TCR 的比例。

  Treg(图 8A):M 组Treg 比例高于K 组,给药后 TP-5 组比例下调,CY+今幸组轻微下调,提示该模型下,今幸 对脾脏中 Treg 的作用不明显;

  MDSC(图 8B):M 组 MDSC 比例略高于K 组,给药后 今幸 组、TP-5 组和 CY(1w)+今幸(2w)组比例下调,提示 今幸 单独用药或用在化疗药之后对脾脏中的 MDSC 有下调作用。

  共刺激分子 CD86(图 9A):M 组 CD86 比例高于 K 组,给药后除 CY 组和 CY+TP-5 组,比例均明显上调,今幸 组上调幅度最大,提示 今幸 单用或与化疗药联合用药都能上调 DCs 表面 CD86 分子;MHCII(图 9A):M 组 MHCII 比例略低于 K 组,给药后除 CY 组,比例均上调,提示 今幸 单用或与化疗药联合用药对 MHCII 分子都有上调作用。

  脾脏 PD-1 分子/DCs 表面 PD-L1 分子(图 9B、9C):脾脏中 PD-1 分子的比例,M 组低于 K 组,给药后均下降;DCs 表面 PD-L1 的比例,M 组高于 K 组, 给药后除 CY+TP-5 组比例均下调,提示 今幸 单用或与化疗药联合应用都能下调脾脏中 PD1 的比例和 DCs 表面的 PD-L1 分子的比例。

  1、今幸胶囊与化疗药 CY 联合用药对小鼠皮下移植的 Lewis 肺癌有明显的抑制作用,抑癌效果与 CY 相当,同时能稳定小鼠体重,降低死亡率,且 今幸 单用时未出现死亡。

  2、今幸胶囊在发挥抑癌作用的同时也表现出免疫增强作用,能上调脾脏、胸腺和淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例,上调脾脏中 NK 细胞、巨噬细胞和 TCR 的比例,下调脾脏中 MDSC 的比例,上调 DCs 表面的 CD86 和MHCII 分子的比例,促进 DCs 的成熟,下调脾脏中的 PD1 分子和 DCs 表面PD-L1 分子的比例,从而发挥免疫增强作用。

  3、今幸胶囊还能促进血清中 TNF-和 IL-12 的分泌,增强肿瘤的杀伤作用,调节免疫功能。

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